DEVELOPMENT OF A NEW BIOANALYTICAL METHOD FOR MASS SPECTROMETRIC ANALYSIS OF GLYCOPEPTIDES USING HYDROPHILIC INTERACTION-BASED SORBENTS

Abstract

ABSTRACT

Glycosylation process is a post-translational modification with essential functions for the living proteome. Monitoring of proteins undergoing this modification is very important for the preliminary diagnosis of various diseases. However, the analysis of glycoproteins subjected to this modification presents multiple difficulties. The number of ordinary peptides belonging to glycopeptides are usually very high compared to glycopeptides. This causes suppression of the mass spectrometric signals of the glycopeptides. Therefore, glycopeptides are needed to be enriched for efficient analysis. Sorbents based on hydrophilic interaction (HILIC) are frequently used for the enrichment of glycopeptides because they are inexpensive and easy to apply. In this thesis, a pipette tip application was developed by using HILIC-based sorbents together with cotton wool. Commercially available cellulose and sepharose CL-4B sorbents were used in the study. These sorbents were placed on the pipette tips, and their performance in the enrichment of glycopeptides was tested. First, the optimal elution and loading conditions for glycopeptides were tested, and it was determined that 85% ACN with 1% TFA for loading and 100% H2O for elution were the optimum conditions for both selectivity and detection rate. Pipette tips containing HILIC-sorbent were used to enrich the glycopeptides of human plasma, and it was determined that the pipette tip containing cellulose and cotton thread had the highest N-glycopeptide identification rate. However, an increase in the number of ordinary peptides detected was detected when the cotton wool was used in combination with other HILIC sorbents. As a result of the studies, cotton wool and other HILIC-based sorbents increased the number of N-glycopeptides identified, especially when enrichment was made on complex samples. The results from this study are expected to contribute to the literature regarding site-specific clinical glycosylation analysis.

ÖZET

Glikozilasyon canlı proteomu için önemli işlevleri bulunan bir post-translasyonel modifikasyondur. Bu modifikasyona uğrayan proteinlerin izlenmesi çeşitli hastalıkların ön tanısının koyulması için çok önemlidir. Fakat bu modifikasyona uğrayan glikoproteinlere ait glikoptitlerin analizler çeşitli zorluklar içermektedir. Glikopeptitlere ait sıradan peptitlerin miktarı genellikle glikopeptitlere göre çok yüksektir. Bu, glikopeptitlerin kütle spektrometrik sinyallerinin baskılanmasına sebep olmaktadır. Bu nedenle glikopeptitlerin verimli analizleri için zenginleştirilmelerine ihtiyaç vardır. Hidrofilik etkileşime (HILIC) dayalı sorbentler ucuz ve kolay uygulanabilir olmaları nedeni ile glikopeptitlerin zenginleştirilmelerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Bu tez kapsamında HILIC temelli sorbentler pamuk ipliği ile birlikte kullanılarak bir pipet ucu uygulaması geliştirilmiştir. Çalışmada ticari olarak edinebilen selüloz ve sefaroz CL-4B sorbentleri kullanılmıştır. Bu sorbentler pipet uçlarına yerleştirilerek glikopeptitlerin zenginleştirilmelerindeki performansları test edilmiştir. İlk olarak, glikopeptitler için en uygun elüsyon ve yükleme koşulları test edilmiş ve elüsyon için %100 H2O ve yükleme için de %1 TFA içeren %85 ACN’nin hem seçicilik hem de tanımlama oranı bakımından en optimum koşullar olduğu belirlenmiştir. HILIC-sorbent içeren pipet uçları insan plazmasına ait glikopeptitlerin zenginleştirilmesi için kullanılmış ve selüloz ve pamuk ipliği içeren pipet ucunun en yüksek N-glikopeptit tanımlama oranına sahip olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte, pamuk ipliği, diğer HILIC-sorbentlerle birlikte kullanıldığında tespit edilen sıradan peptitlerin miktarında artış tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda özellikle kompleks örnekler üzerine zenginleştirme yapıldığında pamuk ipliği ile birlikte diğer HILIC temelli sorbentlerin kullanılması N-glikopeptitlerin tanımlanma sayılarını artırmıştır. Bu çalışmadan elde edilen sonuçların bölgeye-özgü kliniksel glikozilasyon analizleri açısından literatüre katkı sunması beklenmektedir.